6.1.2 การเพิ่มจำ�นวน DNA ด้วยเทคนิค PCR
ครูนำ�เข้าสู่บทเรียน โดยให้นักเรียนศึกษารูป 6.4 ในหนังสือเรียนที่แสดงการเข้าคู่กันของ
ไพรเมอร์มีลำ�ดับเบสที่เป็นเบสคู่สมกับลำ�ดับเบสบนสายดีเอ็นเอแม่แบบ และรูป 6.5 การเพิ่มปริมาณ
DNA โดยเทคนิค PCR แล้วร่วมกันวิเคราะห์และอภิปรายเพื่อนำ�ไปสู่การสืบค้น โดยมีประเด็นอภิปราย
ดังนี้
ลำ�ดับเบสของไพรเมอร์มีความสำ�คัญอย่างไรต่อตำ�แหน่งการเพิ่ม DNA
เทคนิค PCR มีขั้นตอนอย่างไร
การเพิ่มอุณหภูมิให้สูง ทำ�ให้ DNA สายคู่ แยกออกจากกันได้อย่างไร
การเพิ่มจำ�นวน DNA ที่ต้องการจำ�นวนมากโดยเทคนิค PCR นำ�มาประยุกต์ใช้ประโยชน์
ในด้านใดบ้าง
จากการสืบค้น การวิเคราะห์ และอภิปราย นักเรียนควรได้ข้อสรุปว่า เทคนิค PCR เป็นการเพิ่ม
จำ�นวน DNA ในหลอดทดลองเพื่อให้ได้โมเลกุลของ DNA ที่เหมือนกันในปริมาณมาก โดยใช้
เครื่องเทอร์มอลไซเคลอร์ โดยทั่วไปในการทำ�ปฏิกิริยา PCR เป็นการเพิ่มจำ�นวน DNA บางบริเวณ
ไม่ได้ครอบคลุมทั้งสายของ DNA ต้นแบบ ถ้าต้องการเพิ่มจำ�นวน DNA ที่บริเวณใด ให้เลือกไพรเมอร์
ที่มีลำ�ดับเบสเป็นเบสคู่สมกับดีเอ็นเอแม่แบบที่จุดเริ่มต้นของแต่ละสายซึ่งครอบคลุมบริเวณนั้นของ
สายดีเอ็นเอแม่แบบซึ่งมีลำ�ดับเบสเป็นเบสคู่สมกับไพรเมอร์
กระบวนการสังเคราะหดีเอ็นเอ ทำ�ได้โดยใช้ดีเอ็นเอแม่แบบ ไพรเมอร์ นิวคลีโอไทด์ 4 ชนิด คือ
นิวคลีโอไทด์ที่มีเบส A T G และ C และเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสใส่ในหลอดทดลองที่มีสารละลาย
บัฟเฟอร์ที่เหมาะสมต่อการเกิดปฏิกิริยา การเกิดปฏิกิริยาใน 1 รอบ มีลำ�ดับขั้นตอน ดังนี้
1. เพิ่มอุณหภูมิให้สูง ทำ�ให้ดีเอ็นเอแม่แบบสายคู่แยกออกเป็นสายเดี่ยว เนื่องจากพันธะ
ไฮโดรเจนระหว่างพอลินิวคลีโอไทด์ 2 สายถูกทำ�ลาย
2. ลดอุณหภูมิลง ทำ�ให้ไพรเมอร์จับกับสายดีเอ็นเอแม่แบบด้วยพันธะไฮโดรเจน
3. ปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมต่อการทำ�งานของเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ซึ่งจะนำ�
นิวคลีโอไทด์อิสระมาต่อที่ปลาย 3’ ของไพรเมอร์ไปเรื่อยๆ ทำ�ให้เกิดการจำ�ลองสาย DNA
จากสายดีเอ็นเอแม่แบบ
4. เพิ่มอุณหภูมิให้สูงขึ้น ทำ�ให้สาย DNA สายคู่ที่เกิดจากปฏิกิริยารอบที่ 1 แยกออกจากกัน
และเกิดปฏิกิริยาในรอบต่อไป
สถาบันส่งเสริมการสอนวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี
บทที่ 6 | เทคโนโลยีทางดีเอ็นเอ
ชีววิทยา เล่ม 2
155
เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม เป็นเครื่องมือวิทยาศาสตร์ที่มีในห้องปฏิบัติการที่ทำงานเกี่ยวข้องกับ DNA โดยเป็นเครื่องมือที่ใช้ประกอบกับเทคนิค PCR ในการเพิ่มปริมาณ DNA ขึ้นในหลอดทดลอง การรู้ถึงหลักการของเครื่องมือ วิธีการใช้งานอย่างถูกต้อง จะทำให้ผลการทดลองหรืองานวิจัยนั้นมีความน่าเชื่อถือ
เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม เป็นเครื่องมือวิทยาศาสตร์ที่มีในห้องปฏิบัติการที่ทำงานเกี่ยวข้องกับ DNA ลักษณะของเครื่องเหมือนหม้อหุงข้าว เมื่อเปิดฝาออกภายในมีหลุมสำหรับใส่ตัวอย่าง ขนาด 0.2 ml จำนวน 48-96 หลุม (ตามคุณสมบัติของแต่ละเครื่อง) เครื่องนี้มีความสามารถในการปรับเปลี่ยนอุณหภูมิร้อนและเย็น และในแต่ละช่วงอุณหภูมินั้นสามารถตั้งเวลาได้ การทำงานจะเปลี่ยนอุณหภูมิ ระยะเวลา ตามโปรแกรมที่ตั้งไว้ หมุนเวียนกันไปนับเป็นจำนวนรอบ โดยในช่วงอุณหภูมิและระยะเวลาที่แตกต่างกันจะส่งผลต่อตัวอย่าง DNA ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงขึ้นในหลายลักษณะ เทคนิคที่ใช้ในการเพิ่มปริมาณ DNA ขึ้นในหลอดทดลอง เรียกว่าเทคนิคพีซีอาร์ หรือ polymerase chain reaction เทคนิคนี้จะเพิ่มปริมาณ DNA ขึ้นโดยอาศัยหลักการการจำลองตัวเอง ในธรรมชาติ DNA จะอยู่เป็นสายคู่บิดเกลียววนขวา ประกอบด้วยเบส A T C และ G การเพิ่มปริมาณ DNA ในหลอดทดลองจะมี 3 ขั้นตอนคือ
1) Denaturation เป็นการแยกสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบจากสภาพที่เป็นเส้นคู่ให้เป็นเส้นเดี่ยวโดยใช้อุณหภูมิในช่วง 92-95 องศาเซลเซียส
2) Annealing เป็นขั้นตอนที่ลดอุณหภูมิลงอยู่ในช่วง 50-60 องศาเซลเซียส และใช้ไพรเมอร์ซึ่งเป็นดีเอ็นเอสายสั้น ๆ (ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์จำนวน 17-24 เบส) ที่มีลำดับเบสเป็นเข้าคู่กับสายดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบจับคู่กัน
3) Extension เป็นขั้นตอนการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่โดยสังเคราะห์ต่อจากส่วนปลายของไพรเมอร์ (ที่ใส่เข้าไปในขั้นที่สอง) ตามข้อมูลบนดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบแต่ละสายโดยอาศัยการทำงานของเอ็นไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอร์เรส (DNA polymerase) ซึ่งเอนไซม์นี้ทำงานได้ดีที่สุดที่อุณหภูมิ 72-75 องศาเซลเซียส
การทำ PCR ขั้นตอนที่ 1 ถึง 3 นับเป็นจำนวน 1 รอบ ให้ผลผลิตเป็นดีเอ็นเอสายคู่ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สมกับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบ เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า และเมื่อทำ PCR ขั้นตอนที่ 1 ถึง 3 หมุนเวียนไปอีกหลาย ๆ รอบ ปริมาณดีเอ็นเอจะเพิ่มขึ้นได้หลายเท่าทวีคูณ กล่าวคือปริมาณ DNA จะเพิ่มตามจำนวนรอบในการทำ PCR โดยปริมาณ DNA จะเท่า 2n เมื่อ n เท่ากับจำนวนรอบ
เทคนิค PCR นี้สามารนำไปใช้ประโยชน์ในการวิจัยด้านต่างๆ เช่นทางการแพทย์ ใช้ในการวินิจฉัยโรคต่าง ๆ ทั้งโรคติดเชื้อและโรคจากพันธุกรรม ได้แก่ การตรวจหาเชื้อไวรัสหรือแบคทีเรียที่เป็นสาเหตุของโรค ทำให้การวินิจฉัยโรคเพื่อป้องกันและรักษาเป็นไปอย่างมีประสิทธิภาพมากยิ่งขึ้น ทางการเกษตร มีประโยชน์ต่อการตรวจวินิจฉัยโรคพืช การตรวจสอบสายพันธุ์พืช นอกจากนี้แล้วเทคนิคพีซีอาร์ ยังช่วยให้เข้าใจพันธุกรรมของเชื้อโรคพืช ตลอดจนการนำไปใช้ในการป้องกันกำจัดโรคพืชที่เกิดจากเชื้อรา แบคทีเรีย และไวรัส หรือเชื้อสาเหตุโรคอื่น ๆ